毒理检测—替代试验那些事
时间: 2021-03-30 08:49:05     来源: 申江替代论坛

   毒理检测的目的是测试食品、药品、化妆品、消毒剂、农药等产品或者化学物在特定使用方式或者暴露条件下，是否对人体安全、生态环境造成影响。通常采用一定的方法、程序或指导原则进行。毒理检测是产品安全性评价、化学物危害评估、环境危害评估等的具体支持手段，也是各个国家的法规要求。长期以来，毒理检测的核心方法是动物试验。

02 毒理检测替代试验

   首先要明确两个概念，“in vitro test”和“Alternatives”。“in vitro test”即体外试验，为以细胞、组织等为材料进行的试验，早已成为基础医学研究、生物学研究、新药研发等领域的基本研究方式。“Alternatives”英文译意有“备选方法”、“替代方法”、“其他方法”的意义，这个概念最早进入中国时被译为“替代方法”，一直沿用至今。本文谈论的替代试验（方法）即“Alternatives”，可以狭义地理解为那些采用一定的方式来替代传统的动物实验、从而达到毒理学检测和评价目的的方法。当然，“Alternatives”中大部分的方法就是所谓的“in vitro test”。

替代试验的历史渊源始于上世纪50年代西方国家兴起的动物保护和动物福利运动，特别是英国科学家“Russell”和“Burch”出版的著名的《人道试验技术原则》（《The principle of humane experimental technique》）提出的3R理论，即减少（Reduce）、优化（refine）、代替（Replace），提出可以采用低等动物代替高等动物或采用完全的非动物实验、优化动物实验操作减少动物痛苦和使用数量的理念，“Alternatives”的提出即源于此。3R原则的提出对各国实验动物法规影响深远，也激发了替代试验研究的兴起、验证认可机制的建立、法规关于动物实验的限制。经过近50年的发展，目前更倾向于开发那些完全替代动物实验的毒性测试方法。

毒理检测替代试验的兴起除了上述原因，也与传统动物实验的缺陷有关。动物实验测试周期长，成本高，无法实现高通量，动物试验外推到人有不确定性，比如药物动物实验的毒性结果与人体临床试验存在相当比列的差异，动物实验的暴露剂量和暴露时间与人类实际暴露情况也会存在较大差异。

毒理检测替代试验的方法主要是将试验对象从动物转至细胞、体外三维培养的组织、离体组织等，近年来，基于微流控器官芯片、诱导性多功能干细胞（iPS cells，induced pluripotent stem cells）、细胞成像等技术的发展，体外替代方法测试的通量和准确度获得极大提高。同时，计算机科学、生物信息学的发展提供了不少非实验方法，如定量结构-活性模型（QSAR，quantitative structureactivity relationship）、分组交叉参照（grouping and read-across)等，完全可以不通过实验手段就可以评估受试物的毒性效应。

03 替代试验国际化

随着毒理检测传统动物实验方法革命性变革，替代试验方法的研究热情高涨，但随之而来的问题是这些不断出现的新方法结果是否可信？如何去验证它的准确性和适用性？1991年欧洲率先建立了“欧洲替代方法验证中心”（European Center for Validationof Alternative Methods，ECVAM），1993年美国成了“替代方法验证协调委员会”（Interagency CoordinatingCommittee on the Validation of Alternative Methods，ICCVAM，2005年日本成立“替代方法验证中心”（Japanese Center for theValidation of Alternative Methods，JaCVAM）。之后，更多的国家建立了替代方法验证中心，比如韩国的KoCVAM，巴西的BraCVAM，印度的SAAE（动物替代试验协会）等。这些机构的设立，既可推动本国替代试验研发与转化工作，也利于新的方法获得国际认可渠道，最终为法规和标准体系所接受。

在法规层面，欧洲对动物实验的限制走在最前列。2003年欧盟通过2003/15/EC指令提出了逐步淘汰动物试验的时间表，欧盟的化妆品法规规定2004年3月始禁止化妆品成品的动物实验，2009年3月有条件禁止化妆品成分的动物实验， 2013年3月11日起，全面禁止化妆品的动物实验，并禁止销售经过动物测试的化妆品。2006年欧洲发布的REACH法规（化学品注册、评估、授权和限制法规）明确提出需采用经过验证的替代试验方法进行测试以避免动物实验。ICH（人用药品注册技术要求国际协调会）、FDA（美国食品药品监督管理局）、EPA（美国环保署）等相继颁布相关管理法规和技术指南，要求或推荐采用替代试验。亚洲的韩国和台湾地区化妆品法规对于动物实验也做出了限制。

OECD（经济合作与发展组织），是全球30个市场经济国家组成的政府间国际经济合作组织，虽然目前中国只是观察员国家，但是加入OECD只是时间问题。OECD的测试指南(TG)是国际通用的方法指南体系，目前已经纳入几十种替代试验方法，包括急性毒性测试、皮肤刺激/腐蚀性测试、眼刺激/腐蚀性测试、皮肤致敏测试、基因/致突变测试、光毒性测试等，还包括不少用于内分泌干扰物筛选、水生生物生态毒性检测等 “Alternatives”的方法，而且对新方法的“验证程序”也被收录入到指南中。

2007年美国国家研究委员会（National Research Council，NRC）发表了毒理学领域里程碑式的报告，即《21世纪毒性测试：愿景与策略》（TT21C），强调21世纪毒性测试的重点将由整体动物实验转向人类细胞、体外组织等替代方法的测试策略，拉开了21世纪现代毒理测试的序幕。美国和欧洲分别启动了大型的战略项目，比如美国“Tox21”、“ToxCast”项目，2010年欧洲联合建立了AXLR8项目，这些大型框架性项目本着采用恰当的高通量体外方法，完成化学物毒性数据库的建立。这些项目旨在对没有毒性数据的化学物建立完整的毒性资料数据，或者补充一些化学物毒性资料的不全，并且实现数据库共享。目前在TT21C引导下，基于有害结局路径（AOP，Adverse outcome pathway）模式的测试工作已经取得很好的进展。

04 替代试验中国现状

2000年之后，国内一些部门和机构开始关注毒理检测替代试验，一些单位也在不断研究和转化替代试验。但在早期，3R理论和动物福利的意识在国内的接受度尚弱，特别是生产企业极少有非动物实验的概念。随着理念的进步和方法转化的跟进， 2008年前后，由全国危险化学品管理标准化技术委员会提出了系列的化学品国家标准，这些标准等同采用OECD标准，其中包括不少替代方法的标准，如《GB/T21769—2008 化学品体外3T3中性红摄取光毒性试验方法》、《GB/T 27830—2011 化学品体外皮肤腐蚀人体皮肤模型试验方法》等等。原出入境检验检疫系统也发布了不少替代方法的行业标准，比如SN/T 4577-2016《化妆品皮肤刺激性检测 重建人体表皮模型体外测试方法》，行业标准更侧重于对产品的测试。国内个别第三方机构也已建立开展替代试验的能力。

当前中国的法规和标准体系虽然还没有摒弃动物实验，大部分领域的安全性评价法规仍然要求动物实验，但应当看到政府层逐渐显现的积极态度。2014年6月，原国家食药监局发布了“关于调整化妆品注册备案管理有关事宜的通告”(第10号公告)，对于非特殊类化妆品，去除了强制性动物实验的要求，接受风险评估资料。国家市场监管局自2016年起，不断发布“化妆品安全技术规范”替代试验标准，至今已发布6项，有2项皮肤变态反应试验为优化的动物实验，其余4项为完全替代试验，但是全部是针对原料的测试。目前中国采取的是化妆品成品监管模式，这些标准的应用性存在问题，但是至少已经在释放积极信号。可以预见部分领域替代试验法规接受已在路上。

05 小结

   中国未来采取原料监管为主的模式是大概率，加入OECD组织也是时间问题，因而尽早参与国际化学品毒性数据库建立的框架工作中是十分有意义的，采取国际分工协作，采用基于AOP通路的新型高通量毒理测试手段，共同建立完整和动态的毒性数据库系统，可通过大数据关联共享，节省资源，并十分有利于相关的政府监管工作。

   加入WTO以后，由于法规要求的迥异，我国仍然采用动物实验测试，使得一些商品的进出口贸易特别是进口贸易出现了问题，为此中国政府也面临着来自国际的强大压力。2021年1月，中国已允许法国进口的普通化妆品，在生产商获得质量管理体系资质认证并进行安全性评估后，出口到中国的产品可以免于进行动物实验，彰显了逐步开放的态度。

邱璐，上海海关动植物与食品检验检疫技术中心毒理与功效实验室主任，研究员。长期从事实验室毒理学安全性测试和评价工作。在探索新型毒理测试方法（非动物试验/替代方法）的研究和应用工作中，带领团队，走在全国的前列。其研究成果多次获得上海市科委、（原）国家质检总局科技进步奖，并已转化多个行业和国家标准。特别重视新技术的实践应用和非动物试验理念在国内推广，在国内起到了示范引领作用。

本文选自《未来实验室学苑》