眼刺激试验替代方法
时间: 2015-11-09 11:50:08 来源: 申江替代论坛
眼刺激试验替代方法（一）概述
眼刺激测试方法替代方法的最终目标是通过单独替代方法、替代方法组合或作为测试策略组成的替代方法，最终完全替代OECD 测试指南405 Draize兔眼刺激试验。该测试指南已经包含一系列测试的策略，包括利用理化数据，构效关系以及已验证体外方法的测试结果。目前为止，Draize试验的体内以及体外的替代方法都得到快速发展。
人的眼睛是一个复杂的器官，包括各种不同类型的组织和细胞。角膜组成眼睛外屏障，结膜是眼睛暴露眼刺激物后最容易影响的组织。自上个世纪中期，尽管在科学和道德原因上被广为批判，Draize兔眼刺激试验广泛用于评估受试物的潜在眼刺激性。其中最受批评的是受试物的暴露方法（大量的化合物作用于结膜，并不能代表人们的暴露方式）和主观评分系统。此外，兔眼和人眼的解剖和生理的差异（兔眼存在瞬膜，缺少泪腺）进一步限制了兔眼模型的可靠性。由于这些缺陷，加上非标准化测试条件、试验结果的可变性，使得其作为眼刺激替代方法作为“金标准”的价值受到质疑。
为满足科学和伦理道德的需要，OECD TG405修改（OECD，2002）和法规440/2008/EC（EU，2008）进行了修改，包含了系列测试策略。该方法包含了运用理化数据、结构-活性关系和经验证的体外方法的数据。
体内的替代方法 体内LVET（小体积眼刺激试验）方法已经过科学性验证作为体内方法的优化方法。该方法避免了Draize试验的局限，仅需样品体积的十分之一，并非放置在结膜，而直接作用于角膜。
体外的替代方法 Draizes兔眼刺激试验的非动物替代方法代表监管目的的体内动物试验替代的最大的领域之一。过去十年，已经发展了大量的替代方法，并对这些方法进行验证。2009年，两种替代方法（BCOP和ICE）以及2012年FLT试验得到监管机构的认可作为化学品眼腐蚀性和严重刺激评价的替代方法，并允许特定情况下使用。
眼刺激替代方法（二）试验系统
一、测试系统
DB-ALM关于“局部毒性-眼刺激”包含了70种不同的替代方法，根据测试体系类型的不同方法进行分类：
- 细胞培养试验
- 基于微生物的测试
- 基于组织的测试
- 离体器官试验
- 移植试验
- 理化方法
- QSAR（定量构效关系）方法
- 整体动物试验（优化/非脊椎动物）
测试系统从离体器官、3D组织重建到细胞培养，因此，非常复杂。整体动物模型包括小体积眼刺激试验以及新型Slug粘膜刺激试验。
二、观察终点
细胞培养方法以及基于组织的方法（3D组织重建如利用原代或永生化细胞的重建角膜模型）多数情况下观察终点为细胞毒性作用：细胞生存率变化、细胞膜完整性等。新型细胞培养方法包括测试炎症介质释放（如细胞因子释放试验）或神经元刺激（感觉神经细胞模型）。
器官测试方法模拟靶组织眼睛的影响。如BCOP或PCOP测试角膜的透明度和渗透性
眼刺激试验替代方法（三）方法验证
过去几十年里，许多研究关注Draize兔眼刺激试验体外替代方法，并得到国际上监管的认可，而一些方法则做为公司内部的筛查方法。
1. 方法验证活动
在20世纪90年度欧洲、日本和美国发起九个正式的大规模验证项目：
1. JASEE五种细胞毒性测试实验室间验证（1998）；
2. OPAL项目（1991）；
3. BGA/BMBF Draize眼刺激试验替代方法国家验证（1990）；
4. COLIPA国际验证（1997）；
5. CTFA替代方法评价项目（1991、1994、1996）；
6. EC/HO Draize眼刺激试验替代方法国际验证；
7. 欧盟初步的评价研究（1991）；
8. MHW/JCIA 实验室间验证（1994、1999）；
9. SDA替代项目（1994、1988、1989）
这些方法已经获得满意的结果，然而，没有一种单独方法能够替代Draize眼刺激试验。眼刺激替代方法的验证的建议如下：
A. 建立和使用验证试验的参考标准；
B. 使用组合测试策略；
C. 回顾性验证：分析现有资料；
D. 眼刺激机制学研究。
此外，欧盟联合研究中心对部分BfR DSS（眼刺激危害认定结合化学物的结构和理化性质等信息）进行了验证。
除上述较大规模验证活动外还包括一些方法的预验证活动，如BCOP方法、IRE方法、重组人角膜模型。USA的IRAG以及ICCVAM、NICEATM专家组对这些替代方法的技术水平的评估工作与这些验证活动同步进行。ESAC对BCOP、ICE和HET-CAM用于评价严重眼刺激物方法过程进行了同行评议，基于同行评议结果，建议欧盟采纳BCOP和ICE用于严重眼刺激的分类和标签。此外，ESAC建议IRE和HET-CAM进一步分析和改进，以及针对非严重和无刺激物的适用性将提交ECVAM进行回顾性评价。
基于器官的测试方法如IRE、ICE、BCOP和HET-CAM已被欧盟多个成员国接受用于严重眼刺激物的评价。
2. 监管机构认可
（1） 2009年BCOP与ICE方法、2012年荧光素漏出试验FLT被OECD接受，允许特定情况下使用，EU 化学物分级分类R41、US EPA分类和UN GHS分类1描述了其用于评价化学物眼腐蚀性和严重刺激的局限性；
（2） LVET和SM试验得到科学性验证，特定情况下，将用于监管目的使用眼刺激性组合测试策略的初步判断，在特定化学物评价存在一定局限；
（3） ESAC强调RBC和NRR方法提供的证据不足以证明可推荐用于监管目的。
（4） EpiOcularTM和SkinEthicTM HCE方法的验证正在进行。
眼刺激试验替代方法（四） 方法介绍
培养试验
终点 | 方法/测试 |
细胞形态 | 细胞形态分析 HTD测试 |
CEWC 细胞迁移 | CEWC 测试 |
细胞存活和/或线粒体功能 | 台盼蓝染料排斥试验 MTT试验 角膜细胞WST-1细胞毒性试验 Resazurin（Alamar BlueTM）细胞毒性试验 NRU试验 非水溶性物质插入转运 RCE模型 STE（短时暴露）试验 |
细胞增殖 | 蛋白含量测定（Lowery，KB，考马斯亮蓝） CVS测试 集落形成试验 生长抑制试验 |
细胞粘附 | 细胞分离试验 |
膜损伤 | RBC测试 铬（Cr51）释放测定试验 LDH释放试验 NRR测试 FLT测试 荧光染色试验 TER和TEP测定 琼脂扩散法 细胞裂解法 |
细胞代谢 | SM法或细胞传感器微生理仪 尿嘧啶吸收抑制试验 亮氨酸掺入试验 ATP测试 |
介质释放 | CEPA法 细胞因子释放测试 |
2. 基于微生物的方法
终点 | 方法/测试 |
光排放减少 | LBT 试验（MicrotoxTM） |
活力 | TMT试验 |
3. 基于组织的方法
终点 | 方法/测试 |
离体组织 | |
回肠收缩 | 兔离体末端回肠模型 |
细胞活率 | 天然海绵凝胶组织培养试验 |
组织模型 | |
TEP,TER,细胞活率 | HCE-T 角膜组织重组模型 |
细胞活率 | 原代（牛、猪、人）角膜细胞重组角膜模型 SkinEthicTM 人角膜上皮模型 EpiOcularTM试验 利用成纤维细胞的TEA和其他皮肤模型 LDE试验 REC试验 |
混浊、细胞活率、基因表达 | 利用永生化人角膜细胞的重组角膜模型 |
神经肽SP释放 | 等量神经支配的人角膜 |
细胞活率、细胞因子测定、荧光素漏出 | 使用角质细胞的EPISKIN和其他皮肤模型 |
眼刺激试验替代方法（四） 方法介绍
1. 离体器官方法
终点 | 方法/测试 |
离体器官 | |
角膜渗透性 | 小鼠眼渗透性试验 |
角膜厚度、细胞完整性 | BEET试验 |
角膜厚度、角膜浑浊度、荧光素停留 | ICE试验 |
角膜厚度、角膜浑浊度、荧光素停留、角膜结果和完整性 | IRE试验 |
角膜浑浊度、角膜厚度 | 短期离体（牛、猪）角膜试验 |
角膜上皮完整性 | 长期角膜器官培养试验 |
角膜厚度、角膜浑浊度、角膜水合作用、角膜渗透性、角膜结构和完整性 | BCOP试验、PCOP试验 |
局部长度变异性、光透明性 | 眼晶状体培养试验 |
介质释放 | BECUP模型 |
鸡胚卵内 | |
血管出血、裂解、凝血 | HET-CAM试验 |
细胞活率 | CAM-TBS试验 |
血管损伤 | CAMVA试验 |
出血、充血 | 鸡卵黄囊血管试验 |
角膜浑浊度、注入、出血、凝血 | BECAM试验 |
2. 基于植物的方法
终点 | 方法/测试 |
花粉管生长 | PTG试验 |
3. PC方法
终点 | 方法/测试 |
PH检测、酸/碱保留测定 | PH测定和酸/碱保留 |
光密度 | EYTEXTM系统 |
TIF轮廓 | 角膜蛋白TIF |
膜损伤 | 脂质体眼刺激试验 |
蛋白变性 | 血红蛋白变性试验 |
4. QSAR方法
终点 | 方法/测试 |
- | QSAR预测眼刺激 |
- | BfR决定支持系统 |
5. 整体动物方法
终点 | 方法/测试 |
优化试验 | |
角膜混浊、虹膜损伤、结膜刺激 | LVET |
非脊椎整体动物试验 | |
粘液产生，酶活性，蛋白质含量 | 蛞蝓粘膜刺激试验 |
